Блог

Электрофорез в агарозном геле — традиционный метод разделения и идентификации нуклеиновых кислот в лабораториях молекулярной биологии. Нуклеиновые кислоты представляют собой амфотерные электролиты с изоэлектрической точкой pH 2–2,5. В обычных буферах для электрофореза (рН около 8,5) молекулы нуклеиновой кислоты заряжены отрицательно. Заряд движется к положительному полюсу электрического поля. С помощью технологии электрофореза можно разделить молекулы РНК разного размера и конформации и, наблюдая за количеством, размером и формой полос, можно судить о целостности молекул РНК. В этом процессе основной функцией буфера для электрофореза является поддержание pH и придание раствору определенной проводимости. TAE (буфер трис-уксусной кислоты) и TBE (буфер для электрофореза трис-борной кислоты) являются обычно используемыми буферами. В чем разница между ними? TAE (трис-ацетатный буфер) Преимущество: ① Для фрагментов ДНК размером более 13 КБ буфер TAE позволяет добиться лучших результатов разделения. ② В буфере TAE сверхспиральное состояние ДНК может лучше сохранять свою истинную относительную молекулярную массу во время электрофореза. ③Подходит для восстановления фрагментов ДНК и последующих реакций ферментативного расщепления и т. д. недостаток:   Буферная емкость невелика, и буфер TAE может постепенно терять свою буферную способность pH во время длительного электрофореза, что приводит к изменению значения pH. TBE (буфер для электрофореза трис-борной кислоты) Преимущество: ① Буферная емкость относительно выше, значение pH можно поддерживать постоянным даже во время длительного электрофореза, и вызвать перегрев резервуара для электрофореза непросто. ② Подходит для электрофоретического разделения более мелких фрагментов, например фрагментов размером менее 1 КБ. Его высокое разрешение позволяет легче различать молекулы разных размеров, тем самым повышая точность экспериментов. недостаток: Содержащийся компонент борной кислоты может повлиять на эффективность восстановления РНК и ДНК и последующие эксперименты с ферментативными реакциями.    

Эй, друзья! Сегодня я собираюсь познакомить вас с очень крутой областью — культурой клеток! Культура клеток на самом деле представляет собой технологию, которая искусственно контролирует среду роста клеток в лаборатории. Проще говоря, это создание идеальной среды обитания для клеток, позволяющей им свободно расти, делиться и распространяться. Представьте себе, что это похоже на строительство небольшого «дома» для клеток, позволяющего им проявить здесь свои способности и потенциал! Применение клеточных культур буквально повсюду! В биомедицине культура клеток помогает нам изучать тайны болезней, проверять новые лекарства и оценивать их эффективность. Вы знали? Эти маленькие «помощники» клеточных культур принесли человечеству множество противораковых лекарств, вакцин и других достижений медицины! Мало того, в области биотехнологии культура клеток также незаменима. Ученые могут использовать технологию культивирования клеток для производства важных белков, гормонов и ферментов и даже заниматься генной инженерией и биосинтезом. Эти технологии не только имеют большой потенциал в области медицины, но также играют важную роль в исследованиях и разработках во многих областях, вызывающих серьезную социальную озабоченность, таких как биотопливо и возобновляемые источники энергии. ?? Конечно, клеточная культура — это сложная и сложная технология, требующая специализированных операций и глубоких знаний. Ученые должны не только выбрать подходящие клеточные линии, но также предоставить подходящую культуральную среду и условия роста, а также отслеживать и контролировать статус роста клеток. Вот некоторые основные шаги и ключевые моменты для культуры клеток: Выберите клетки: во-первых, вам нужно выбрать тип клеток, которые вы хотите культивировать. В зависимости от цели и потребностей исследования могут быть выбраны различные типы клеток, такие как опухолевые клетки, первичные клетки или клеточные линии, трансфицированные определенными генами. Подготовьте культуральную среду: сделайте культуральную среду подходящей для выбранного типа клеток. Культуральная среда представляет собой жидкий раствор, содержащий питательные вещества, факторы роста и добавки, которые обеспечивают питательные вещества и условия окружающей среды, необходимые для культуры клеток. Диссоциация и пассирование клеток. Отделите культивируемые клетки от культуральных сосудов (таких как чашки Петри или колбы) и редиспергируйте их в новые культуральные сосуды. Этот процесс, называемый клеточным пассажем, поддерживает рост и размножение клеток. Контролируйте условия культивирования: Контролируйте условия культивирования, включая температуру, влажность, концентрацию CO2 и значение pH культуральной среды. Эти условия помогают обеспечить подходящую клеточную среду и способствуют здоровому росту клеток. Контроль загрязнения: во время культивирования клеток необходимо поддерживать стерильные условия, чтобы предотвратить заражение бактериями, грибами и другими клетками. Принятие строгих процедур обращения и стерилизации является ключом к обеспечению чистоты культуры. Наблюдение и экспериментальные операции: Регулярно наблюдайте за морфологией, ростом и плотностью культивируемых клеток. В соответствии с конкретными экспериментальными потребностями выполняются обработка клеток, медикаментозное лечение, трансфекция генов и другие операции. Культура клеток – это не только технология, но и искусство. Каждое успешное выращивание — это уважение к жизни и стремление к науке. Я надеюсь, что эта статья даст вам более глубокое понимание клеточной культуры! ??  

1. Экстракция общего тканевого белка: 2.1 Промойте ткань 1-2 раза предварительно охлажденным PBS, разрежьте на мелкие кусочки и поместите в трубку для измельчения, добавьте 3 измельченных шарика диаметром 3 мм и добавьте лизирующий раствор в 10 раз больше объема ткани (например: 100 мг ткани, добавьте 1000 мкл жидкого лизирующего раствора), установите программу измельчения тканей; 2.2. После измельчения вынуть измельчительную трубку и поместить ее на лед или в раствор для лизиса четвертой степени на 30 минут; 2.3. Центрифугируйте при 12000 об/мин и температуре 4°C в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость, представляющую собой раствор общего белка. 2. Определение концентрации белка (дополнительно): при необходимости определите концентрацию белка, возьмите раствор неденатурированного белка и используйте набор для определения концентрации белка BCA для измерения концентрации белка. Конкретные методы см. в инструкциях к набору; 3. Денатурация белка:Добавьте 5* буфер для загрузки белка с пониженным содержанием белка в белковый раствор в соотношении 4:1, денатурируйте его в металлической ванне при 95°C в течение 10 минут и храните в холодильнике при -20°C или -80°C для дальнейшего использования. ; 4. Электрофорез 4.1 Очистите стеклянную пластину; 4.2. Приготовление геля и загрузка образца; 4.2.1 ①. Сначала сдвиньте прижимные пластины с обеих сторон вниз, полностью откройте сальники с обеих сторон, вставьте вогнутое стекло и плоское стекло сверху по диагонали и поместите их вниз. Верхняя часть стекла втыкается в пазы с обеих сторон; ②. Подверните сальники вверх с обеих сторон, зажмите одновременно руками левую часть сальника, потяните левую прижимную пластину вверх и зафиксируйте ее вверху; затем одновременно зажмите правую сторону сальника, потяните правую зажимную пластину вверх и зафиксируйте ее. к высшему; ③. Убедившись, что стекло для электрофореза зажато и выровнено, отвинтите ручки с обеих сторон основания для изготовления геля, затем поместите кронштейн для электрофореза в середину основания для приготовления геля и зажмите его, затем нажмите на кронштейн основного корпуса руками и затяните ручки с обеих сторон до тех пор, пока они не повернутся до предела. 4.2.2 Выберите наборы для приготовления геля различной концентрации в соответствии с экспериментальными требованиями, смешайте растворы A и B в равных пропорциях и приготовьте раствор нижнего геля и раствор верхнего геля соответственно. Для стеклянных пластин различной спецификации и толщины объемы верхнего клеевого и нижнего клеевых растворов можно регулировать в равных пропорциях. Если взять в качестве примера обычно используемую гелевую пластину размером 8,3 см × 7,3 см (цельную), рекомендуемая система подготовки следующая:; Группа рецептур Формулировка Стеклянная пластина 0,75 мм Стеклянная пластина 1,0 мм Стеклянная пластина 1,5 мм Нижний клеевой раствор 10% нижний клеевой раствор А 2 мл 2,5 мл 4 мл 10% раствор нижнего клея B 2 мл 2,5 мл 4 мл AP 24 мкл 30 мкл 48 мкл Верхний клеевой раствор Верхний клеевой раствор А 1 мл 1 мл 1,5 мл Верхний клеевой раствор B (красный цвет) 1 мл 1 мл 1,5 мл AP 12 мкл 12 мкл 18 мкл 4.2.3 После сборки клеевого аппарата сначала добавьте приготовленный раствор нижнего клея, а затем используйте чистую воду или этанол для герметизации нижней поверхности клея. После полного затвердевания нижнего клея (около 10-15 минут) слейте воду или этанол и воспользуйтесь фильтровальной бумагой, чтобы впитать оставшуюся жидкость, затем добавьте приготовленный раствор верхнего клея, вставьте гребенку и подождите, пока он затвердеет ( около 10-15 минут) перед применением; 4.2.4 Снимите основной корпус гелеобразователя, осторожно вытащите гребешок и подготовьтесь к началу электрофореза; 5. Поместив основной корпус гелеобразователя в резервуар для электрофореза, заполните внутреннюю часть буфером для электрофореза и добавьте 1/3 внешней части. Используйте постоянное напряжение 200 В в течение 30 минут, пока бромфеноловый синий не окажется на расстоянии примерно 1 см от дна. Электрофорез завершен, и электрофорез готов к переносу. 6. Трансферная пленка 6.1. Подготовьте 6 кусков трансферной фильтровальной бумаги размером 7×9 см (тонкой) и мембраны из ПВДФ размером 5×8 см. Мембрану из ПВДФ перед использованием необходимо активировать этанолом в течение 2 минут; 6.2 Поместите зажим для переноса, две губки, фильтровальную бумагу и мембрану из активированного ПВДФ в контейнер с раствором для переноса; 6.3 Разложите папку переноса, красным слева и черным справа. Добавьте губку и по три кусочка фильтровальной бумаги с каждой стороны; 6.4 Осторожно снимите разделительный клей и поместите его на фильтровальную бумагу (клей нанесен на боковую часть черного зажима для переноса). Используйте жидкость для переноса, чтобы смыть пузырьки на клее. Медленно приклейте пленку ПВДФ на клей. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки. Затем по очереди наклейте трансферную пленку. Мембранная фильтровальная бумага, губка для переноса; 6.5 Условия переноса (мокрый перенос): постоянный ток, 300 мА в течение получаса. 7. Иммунный ответ 7.1 Поместите перенесенную мембрану в инкубационный бокс, содержащий TBST, быстро промойте ее, затем добавьте 5 мл 5% обезжиренного молока, поместите в шейкер для обесцвечивания и оставьте при комнатной температуре на 30 минут; 7.2. В соответствии с инструкциями к антителам разведите первичное антитело. После настройки вылейте блокирующий раствор в инкубационный бокс, добавьте подготовленное первичное антитело и инкубируйте при 4°C на шейкере в течение ночи (медленно встряхивайте шейкер); 7.3. Соберите первичное антитело, трижды быстро промойте мембрану TBST, затем добавьте TBST, поместите его на шейкер для обесцвечивания для быстрого элюирования, промывайте три раза по 5 минут каждый раз; 7.4. Разведите вторичное антитело TBST в соотношении 1:5000, затем добавьте его в инкубационный бокс, поместите на шейкер, медленно встряхните и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут; 7.5 Быстро промыть мембрану трижды TBST, затем добавить TBST, поместить на шейкер для обесцвечивания для быстрого элюирования, промыть три раза по 5 минут каждый раз. 8. ХемилюминесценцияСмешайте растворы ECL A и B в соотношении 1:1 и отставьте в сторону. Выньте элюированную мембрану из ПВДФ и поместите ее на впитывающую бумагу. Слегка впитайте жидкость на мембране и поместите мембрану в смешанный ECL. В люминесцентной жидкости дайте жидкости полностью погрузить мембрану. После реакции в течение 1 минуты выньте мембрану и поместите ее на лоток для хемилюминесцентных приборов. Запуск хемилюминесценции по заданной программе. После завершения экспонирования сохраните исходное изображение в формате TIFF. 9. Результаты и анализ Всемирного банка

Коллеги, продающие пипетки, часто получают запросы от рекомендованных клиентов: «Можете ли вы дать мне набор пипеток? Их можно использовать во всех диапазонах измерения, как набор из четырех штук». По желанию клиентов клиентам обычно рекомендуются пипетки с четырьмя диапазонами измерения: 0,5–10 мкл, 5–50 мкл, 10–100 мкл и 100–1000 мкл. На первый взгляд кажется, что то, что покупает клиент, охватывает практически весь спектр микропипетирования, и кажется, что все сделано идеально, но это не так! После многих лет послепродажного обслуживания пипеток мы собрали отзывы клиентов о таких проблемах, как неточное дозирование и трудности в использовании, которые часто возникают из-за первоначального выбора набора.Давайте возьмем самый распространенный пример: клиенты часто оставляют больше всего отзывов о пипетировании, когда используют пипетку объемом 10 мкл для переноса жидкостей в пределах 1 мкл. Теоретически пипетка с диапазоном измерения 0,5–10 мкл без проблем работает с жидкостями в пределах 0,5–1 мкл. Почему клиенты часто сообщают о наибольших проблемах именно в этом диапазоне измерений? Ниже 1 мкл — это работа с ультрамикрожидкостью. Количество жидкости практически незаметно невооруженным глазом. Базовые навыки работы с жидкостью очень высоки, такие как: промывка, глубина вставки и другие технические детали. Например: технические детали, такие как промывка, глубина уровня вставляемой жидкости и т. д. Кроме того, качество всасывающей головки также имеет большое значение. большое влияние на эту микрообъемную операцию. Некоторые всасывающие насадки низкого качества могут иметь остатки пластика на кончике всасывающей головки. Такие наконечники низкого качества имеют почти фатальные последствия для микропипетирования. При использовании наконечников нормального качества большинство операторов предпочитают использовать пипетки с диапазоном дозирования 0,1–2 мкл. Для операций по перекачке жидкости объемом менее 1 мкл эффект пипетирования значительно лучше, чем у пипеток с диапазоном 0,5–10 мкл.Ниже мы возьмем пипетку Yanbio в качестве примера для иллюстрации:Общий диапазон регулируемых пипеток обычной точности составляет от 0,1 мкл до 10 мл. Различные диапазоны показаны в таблице ниже:Название предметаКат.№Номинальный объемДиапазон громкостиПриращениеОдноканальная пипеткаYB-P2.52,5 мкл0,1-2,5 мкл0,05 мклYB-P1010 мкл1–10 мкл0,1 мклYB-P2020 мкл2–20 мкл0,1 мклYB-P100100 мкл10–100 мкл1 мклYB-P200200 мкл20-200 мкл1 мклYB-P10001000 мкл100-1000 мкл5 мклYB-P50005000 мкл1000-5000 мкл50 мклYB-P1000010 мл1–10 мл100 мкл8-канальная пипеткаYB-PM1010 мкл1–10 мкл0,1 мклYB-PM100100 мкл10–100 мкл1 мклYB-PM300300 мкл50-300 мкл1 мклYB-PM10001000 мкл100-1000 мкл5 мкл Разные модели пипеток имеют разные диапазоны. Когда мы выбираем пипетку, часто появляется определенный диапазон, и может хватить нескольких пипеток разных моделей. Как выбрать пипетку наиболее подходящего объема.Пример: требуется пипетка, а часто набираемый объем составляет 20 мкл. У нас есть четыре различных типа дозаторов жидкости: 2–20 мкл (модель YB-P20) / 5–50 мкл (модель YB-P50) / 10–100 мкл (модель YB-P100) / 20–200 мкл (модель YB-P200). Какая пипетка имеет наименьшую погрешность при объеме 20 мкл?В соответствии с нашей повседневной практикой выбора продуктов, мы считаем, что было бы наиболее целесообразно, если бы целевой объем находился в среднем диапазоне, и мы эмпирически выберем 5–50 мкл (модель YB-P50). Так ли это? Давайте посмотрим на результаты данных:Давайте воспользуемся этими четырьмя типами пипеток для анализа ошибок:Кот. Нет.:ОбъемОшибка на 20 мклYB-P2020-20 мкл±0,2 мклYB-P505-50 мкл±0,5 мклYB-P10010-100 мкл±0,6 мклYB-P20020-200 мкл±1,0 мклВидно, что пипетка объемом 2–20 мкл является наиболее подходящей с точки зрения точности и точности, а целевой объем 20 мкл является наиболее подходящим.