Метод обнаружения стареющих клеток

I. Обзор клеточного старения

Клеточное старение — это необратимое состояние остановки роста, в которое переходят нормальные клетки после ограниченного числа делений, служащее защитным механизмом для контроля пролиферативного потенциала. Стареющие клетки претерпевают изменения морфологии и метаболической активности; например, увеличивается объем клетки и повышается активность ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), которая становится классическим маркером обнаружения.

II. Метод обнаружения ядра: окрашивание SA-β-галактозидазой

Принцип действия: β-галактозидаза в лизосомах стареющих клеток активна при pH 6,0 (в отличие от нормального pH 4,0) и может катализировать превращение субстрата X-Gal в синий продукт.

Применение: Синий осадок наблюдается с помощью оптической микроскопии. Подходит для клеток, замороженных срезов и цельных препаратов тканей.

Рекомендуемые товары:

Специальный фиксатор (кат. № YB2225)

Набор для окрашивания клеток (кат. № YB2173)

Набор для окрашивания целых тканей (кат. № YB2241, включает просветляющий раствор, облегчает нарезку образцов после окрашивания целых препаратов).

III. Маркеры старения и рекомендации по выбору антител

Согласно рекомендациям журнала Cell, маркеры старения подразделяются на несколько классов; для повышения специфичности рекомендуется их комбинированное использование:

Маркеры остановки клеточного цикла

• p21 (кат. № YB265313 / YB260038): Ингибитор CDK, действующий на белок p53, ключевой фактор необратимой остановки клеточного цикла.
• p16INK4a (кат. № YB261143 / YB261605): Наиболее специфический маркер старения, постоянно демонстрирующий повышенную экспрессию.

Отрицательные маркеры пролиферации

• Ki67 (кат. № YB221499 / YB260023): Используется для исключения пролиферирующих клеток и подтверждения остановки клеточного цикла.
• PCNA (кат. № YB22010 / YB23010): Снижение экспрессии указывает на остановку клеточного цикла, тогда как повышение уровня может свидетельствовать о восстановлении повреждений ДНК.

Изменения ядерной структуры и хроматина

• Ламин B1 (кат. № YB221802 / YB261802): Потеря этого белка ядерной ламины приводит к нарушению целостности ядра.
• HMGB1 (кат. № YB26103 / YB22103): Потеря ядерной локализации и высвобождение во внеклеточное пространство, что приводит к воспалительному старению.
• γH2A.X (кат. № YB221841): Маркер двуцепочечных разрывов ДНК (фосфорилирован по Ser139).

Секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP)

• ИЛ-6, ИЛ-1β, ИЛ-8, ФНО-α (кат. № YB22117 / YB22113 и др.): Провоспалительные цитокины, формирующие хроническую воспалительную микросреду.
• p-STAT3 (кат. № YB260001): Ключевая сигнальная молекула, активирующая SASP и метаболическое перепрограммирование.

Маркеры метаболизма и окислительного стресса

• 4-HNE (кат. № YB260073): продукт перекисного окисления липидов, накопление которого приводит к старению.
• MMP3 (кат. № YB26131): Расщепляет внеклеточный матрикс и участвует в ремоделировании тканей.

IV. Ключевые моменты экспериментального планирования

Использование мультиплексных маркеров: отдельные маркеры склонны к ложноположительным результатам. Для комплексной оценки необходима комбинация маркеров, включающая окрашивание SA-β-gal, белки, вызывающие остановку клеточного цикла (p16/p21), отрицательные маркеры пролиферации (Ki67) и др.

Справочник по валидации in vivo: В тексте представлена ​​таблица положительного контроля для оценки старения тканей мышей (например, экспрессия p21 в стареющей печени, снижение уровня ламина B1 в ткани головного мозга), которая может помочь в выборе модели.

Краткое содержание

Для выявления стареющих клеток требуется предварительный скрининг с помощью окрашивания на активность SA-β-галактозидазы, за которым следует валидация с использованием многомерных маркеров, включая белки, регулирующие клеточный цикл, изменения ядерной структуры и факторы SASP. При выборе антител убедитесь, что каталожные номера соответствуют экспериментальной системе (человек, мышь и т. д.) и методу обнаружения (весбэк, ИГХ/ИФ), чтобы гарантировать достоверность результатов.