Гель-электрофорез

1. Экстракция общего тканевого белка: 2.1 Промойте ткань 1-2 раза предварительно охлажденным PBS, разрежьте на мелкие кусочки и поместите в трубку для измельчения, добавьте 3 измельченных шарика диаметром 3 мм и добавьте лизирующий раствор в 10 раз больше объема ткани (например: 100 мг ткани, добавьте 1000 мкл жидкого лизирующего раствора), установите программу измельчения тканей; 2.2. После измельчения вынуть измельчительную трубку и поместить ее на лед или в раствор для лизиса четвертой степени на 30 минут; 2.3. Центрифугируйте при 12000 об/мин и температуре 4°C в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость, представляющую собой раствор общего белка. 2. Определение концентрации белка (дополнительно): при необходимости определите концентрацию белка, возьмите раствор неденатурированного белка и используйте набор для определения концентрации белка BCA для измерения концентрации белка. Конкретные методы см. в инструкциях к набору; 3. Денатурация белка:Добавьте 5* буфер для загрузки белка с пониженным содержанием белка в белковый раствор в соотношении 4:1, денатурируйте его в металлической ванне при 95°C в течение 10 минут и храните в холодильнике при -20°C или -80°C для дальнейшего использования. ; 4. Электрофорез 4.1 Очистите стеклянную пластину; 4.2. Приготовление геля и загрузка образца; 4.2.1 ①. Сначала сдвиньте прижимные пластины с обеих сторон вниз, полностью откройте сальники с обеих сторон, вставьте вогнутое стекло и плоское стекло сверху по диагонали и поместите их вниз. Верхняя часть стекла втыкается в пазы с обеих сторон; ②. Подверните сальники вверх с обеих сторон, зажмите одновременно руками левую часть сальника, потяните левую прижимную пластину вверх и зафиксируйте ее вверху; затем одновременно зажмите правую сторону сальника, потяните правую зажимную пластину вверх и зафиксируйте ее. к высшему; ③. Убедившись, что стекло для электрофореза зажато и выровнено, отвинтите ручки с обеих сторон основания для изготовления геля, затем поместите кронштейн для электрофореза в середину основания для приготовления геля и зажмите его, затем нажмите на кронштейн основного корпуса руками и затяните ручки с обеих сторон до тех пор, пока они не повернутся до предела. 4.2.2 Выберите наборы для приготовления геля различной концентрации в соответствии с экспериментальными требованиями, смешайте растворы A и B в равных пропорциях и приготовьте раствор нижнего геля и раствор верхнего геля соответственно. Для стеклянных пластин различной спецификации и толщины объемы верхнего клеевого и нижнего клеевых растворов можно регулировать в равных пропорциях. Если взять в качестве примера обычно используемую гелевую пластину размером 8,3 см × 7,3 см (цельную), рекомендуемая система подготовки следующая:; Группа рецептур Формулировка Стеклянная пластина 0,75 мм Стеклянная пластина 1,0 мм Стеклянная пластина 1,5 мм Нижний клеевой раствор 10% нижний клеевой раствор А 2 мл 2,5 мл 4 мл 10% раствор нижнего клея B 2 мл 2,5 мл 4 мл AP 24 мкл 30 мкл 48 мкл Верхний клеевой раствор Верхний клеевой раствор А 1 мл 1 мл 1,5 мл Верхний клеевой раствор B (красный цвет) 1 мл 1 мл 1,5 мл AP 12 мкл 12 мкл 18 мкл 4.2.3 После сборки клеевого аппарата сначала добавьте приготовленный раствор нижнего клея, а затем используйте чистую воду или этанол для герметизации нижней поверхности клея. После полного затвердевания нижнего клея (около 10-15 минут) слейте воду или этанол и воспользуйтесь фильтровальной бумагой, чтобы впитать оставшуюся жидкость, затем добавьте приготовленный раствор верхнего клея, вставьте гребенку и подождите, пока он затвердеет ( около 10-15 минут) перед применением; 4.2.4 Снимите основной корпус гелеобразователя, осторожно вытащите гребешок и подготовьтесь к началу электрофореза; 5. Поместив основной корпус гелеобразователя в резервуар для электрофореза, заполните внутреннюю часть буфером для электрофореза и добавьте 1/3 внешней части. Используйте постоянное напряжение 200 В в течение 30 минут, пока бромфеноловый синий не окажется на расстоянии примерно 1 см от дна. Электрофорез завершен, и электрофорез готов к переносу. 6. Трансферная пленка 6.1. Подготовьте 6 кусков трансферной фильтровальной бумаги размером 7×9 см (тонкой) и мембраны из ПВДФ размером 5×8 см. Мембрану из ПВДФ перед использованием необходимо активировать этанолом в течение 2 минут; 6.2 Поместите зажим для переноса, две губки, фильтровальную бумагу и мембрану из активированного ПВДФ в контейнер с раствором для переноса; 6.3 Разложите папку переноса, красным слева и черным справа. Добавьте губку и по три кусочка фильтровальной бумаги с каждой стороны; 6.4 Осторожно снимите разделительный клей и поместите его на фильтровальную бумагу (клей нанесен на боковую часть черного зажима для переноса). Используйте жидкость для переноса, чтобы смыть пузырьки на клее. Медленно приклейте пленку ПВДФ на клей. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки. Затем по очереди наклейте трансферную пленку. Мембранная фильтровальная бумага, губка для переноса; 6.5 Условия переноса (мокрый перенос): постоянный ток, 300 мА в течение получаса. 7. Иммунный ответ 7.1 Поместите перенесенную мембрану в инкубационный бокс, содержащий TBST, быстро промойте ее, затем добавьте 5 мл 5% обезжиренного молока, поместите в шейкер для обесцвечивания и оставьте при комнатной температуре на 30 минут; 7.2. В соответствии с инструкциями к антителам разведите первичное антитело. После настройки вылейте блокирующий раствор в инкубационный бокс, добавьте подготовленное первичное антитело и инкубируйте при 4°C на шейкере в течение ночи (медленно встряхивайте шейкер); 7.3. Соберите первичное антитело, трижды быстро промойте мембрану TBST, затем добавьте TBST, поместите его на шейкер для обесцвечивания для быстрого элюирования, промывайте три раза по 5 минут каждый раз; 7.4. Разведите вторичное антитело TBST в соотношении 1:5000, затем добавьте его в инкубационный бокс, поместите на шейкер, медленно встряхните и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут; 7.5 Быстро промыть мембрану трижды TBST, затем добавить TBST, поместить на шейкер для обесцвечивания для быстрого элюирования, промыть три раза по 5 минут каждый раз. 8. ХемилюминесценцияСмешайте растворы ECL A и B в соотношении 1:1 и отставьте в сторону. Выньте элюированную мембрану из ПВДФ и поместите ее на впитывающую бумагу. Слегка впитайте жидкость на мембране и поместите мембрану в смешанный ECL. В люминесцентной жидкости дайте жидкости полностью погрузить мембрану. После реакции в течение 1 минуты выньте мембрану и поместите ее на лоток для хемилюминесцентных приборов. Запуск хемилюминесценции по заданной программе. После завершения экспонирования сохраните исходное изображение в формате TIFF. 9. Результаты и анализ Всемирного банка

ВведениеЭлектрофорез нуклеиновых кислот — это фундаментальный метод в молекулярной биологии, используемый для разделения фрагментов ДНК или РНК на основе их размера. Этот метод основан на электрическом поле для перемещения отрицательно заряженных нуклеиновых кислот через гелевую матрицу, как правило, агарозу или полиакриламид. Затем разделенные фрагменты можно визуализировать и документировать с помощью системы гель-документирования, такой как YB-GD1 от Yanbiotech, для точного анализа. Ниже приведен подробный пошаговый протокол для проведения электрофореза нуклеиновых кислот.Требуемые материалы1. Приготовление геля:Агарозный порошок (для электрофореза в агарозном геле)Буфер TAE (трис-ацетат-ЭДТА) или TBE (трис-борат-ЭДТА)Лоток для литья геля и расческаБромистый этидий (ЭБ) или более безопасные альтернативы, такие как SerRed.2. Подготовка образца:Образцы ДНК/РНКЗагрузка красителяЛестница ДНК (стандартный размер)3. Установка для электрофореза:Электрофорезная камераИсточник питанияСистема документирования гелей Yanbiotech YB-GD1 (или УФ-трансиллюминатор для визуализации)Пошаговая процедура1. Приготовление агарозного геля1.1: Подготовьте буфер (обычно 1X TAE или TBE).1.2: Взвесьте необходимое количество агарозы (например, 1% агарозы для стандартного разделения ДНК).1.3: Смешайте агарозу с буфером и нагрейте до полного растворения (в микроволновке в течение 30–60 секунд).1.4: Слегка охладите раствор (~60°C), затем добавьте краситель ДНК (например, EB или SerRed).1.5: Вылейте гель в формочку для литья со вставленной в нее расческой и дайте ему затвердеть (~20–30 мин).2. Загрузка образцов2.1: Осторожно снимите гребенку и поместите гель в камеру для электрофореза.2.2: Заполните камеру достаточным количеством буфера, чтобы покрыть гель.2.3: Смешайте образцы ДНК с загрузочным красителем (для отслеживания миграции).2.4: Загрузите образцы в лунки, включая ДНК-лестницу для определения размера.3. Проведение электрофореза3.1: Подключите электроды (отрицательный к стороне образца, положительный к противоположному концу).3.2: Подайте напряжение (обычно 80–120 В для агарозных гелей).3.3: Продолжайте, пока фронт красителя не пройдет ¾ длины геля (~30–60 мин, в зависимости от размера фрагмента).4. Визуализация и документирование результатов с помощью YB-GD14.1: Отключите питание и осторожно удалите гель.4.2: Поместите гель в систему документирования гелей Yanbiotech YB-GD1 для получения изображений с высоким разрешением.YB-GD1 обеспечивает возбуждение ультрафиолетовым и белым светодиодами, что позволяет визуализировать SerRed и другие распространенные красители нуклеиновых кислот.Высокочувствительная ПЗС-камера обеспечивает четкое и точное обнаружение полос.Сопутствующее программное обеспечение позволяет проводить автоматический анализ полос и оценку размера путем сравнения образцов с ДНК-лестницей.4.3: Сохраните и экспортируйте изображение геля для дальнейшего документирования и публикации.Советы по устранению неполадокРазмазывание: может указывать на деградацию ДНК или слишком большую загрузку образца.Нет полос: проверьте метод окрашивания, условия электрофореза или количество ДНК.Неровные полосы: убедитесь, что гель нанесен равномерно и концентрация буфера правильная.Низкое качество изображения (при использовании YB-GD1): отрегулируйте время экспозиции или настройки фокусировки в программном обеспечении.ЗаключениеЭлектрофорез нуклеиновых кислот — это простой, но мощный метод анализа ДНК и РНК. Тщательно следуя этим шагам и используя систему документирования гелей YB-GD1 от Yanbiotech, исследователи могут добиться высококачественной визуализации, точного определения размеров и профессионального документирования фрагментов нуклеиновых кислот. Этот метод широко используется в клонировании, проверке ПЦР и генетическом дактилоскопировании, что делает его необходимым для лабораторий молекулярной биологии.Почему стоит выбрать YB-GD1 от Yanbiotech?✔ Высокое разрешение изображений для точного обнаружения полос ДНК/РНК✔ Опции УФ и светодиодов для совместимости с несколькими красителями✔ Удобное программное обеспечение для автоматического анализа полос✔ Компактная и эффективная конструкция, идеально подходящая для лабораторных рабочих процессовХотите ли вы получить какие-либо дополнительные изменения или подробности о системе YB-GD1?