Протокол вестерн-блоттинга

1. Экстракция общего тканевого белка:

2.1 Промойте ткань 1-2 раза предварительно охлажденным PBS, разрежьте на мелкие кусочки и поместите в трубку для измельчения, добавьте 3 измельченных шарика диаметром 3 мм и добавьте лизирующий раствор в 10 раз больше объема ткани (например: 100 мг ткани, добавьте 1000 мкл жидкого лизирующего раствора), установите программу измельчения тканей;

2.2. После измельчения вынуть измельчительную трубку и поместить ее на лед или в раствор для лизиса четвертой степени на 30 минут;

2.3. Центрифугируйте при 12000 об/мин и температуре 4°C в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость, представляющую собой раствор общего белка.

2. Определение концентрации белка (дополнительно): при необходимости определите концентрацию белка, возьмите раствор неденатурированного белка и используйте набор для определения концентрации белка BCA для измерения концентрации белка. Конкретные методы см. в инструкциях к набору;

3. Денатурация белка:
Добавьте 5* буфер для загрузки белка с пониженным содержанием белка в белковый раствор в соотношении 4:1, денатурируйте его в металлической ванне при 95°C в течение 10 минут и храните в холодильнике при -20°C или -80°C для дальнейшего использования. ;

4. Электрофорез

4.1 Очистите стеклянную пластину;

4.2. Приготовление геля и загрузка образца;

4.2.1 ①. Сначала сдвиньте прижимные пластины с обеих сторон вниз, полностью откройте сальники с обеих сторон, вставьте вогнутое стекло и плоское стекло сверху по диагонали и поместите их вниз. Верхняя часть стекла втыкается в пазы с обеих сторон;

②. Подверните сальники вверх с обеих сторон, зажмите одновременно руками левую часть сальника, потяните левую прижимную пластину вверх и зафиксируйте ее вверху; затем одновременно зажмите правую сторону сальника, потяните правую зажимную пластину вверх и зафиксируйте ее. к высшему;

③. Убедившись, что стекло для электрофореза зажато и выровнено, отвинтите ручки с обеих сторон основания для изготовления геля, затем поместите кронштейн для электрофореза в середину основания для приготовления геля и зажмите его, затем нажмите на кронштейн основного корпуса руками и затяните ручки с обеих сторон до тех пор, пока они не повернутся до предела.

4.2.2 Выберите наборы для приготовления геля различной концентрации в соответствии с экспериментальными требованиями, смешайте растворы A и B в равных пропорциях и приготовьте раствор нижнего геля и раствор верхнего геля соответственно. Для стеклянных пластин различной спецификации и толщины объемы верхнего клеевого и нижнего клеевых растворов можно регулировать в равных пропорциях. Если взять в качестве примера обычно используемую гелевую пластину размером 8,3 см × 7,3 см (цельную), рекомендуемая система подготовки следующая:;

4.2.3 После сборки клеевого аппарата сначала добавьте приготовленный раствор нижнего клея, а затем используйте чистую воду или этанол для герметизации нижней поверхности клея. После полного затвердевания нижнего клея (около 10-15 минут) слейте воду или этанол и воспользуйтесь фильтровальной бумагой, чтобы впитать оставшуюся жидкость, затем добавьте приготовленный раствор верхнего клея, вставьте гребенку и подождите, пока он затвердеет ( около 10-15 минут) перед применением;

4.2.4 Снимите основной корпус гелеобразователя, осторожно вытащите гребешок и подготовьтесь к началу электрофореза;

5. Поместив основной корпус гелеобразователя в резервуар для электрофореза, заполните внутреннюю часть буфером для электрофореза и добавьте 1/3 внешней части. Используйте постоянное напряжение 200 В в течение 30 минут, пока бромфеноловый синий не окажется на расстоянии примерно 1 см от дна. Электрофорез завершен, и электрофорез готов к переносу.

6. Трансферная пленка

6.1. Подготовьте 6 кусков трансферной фильтровальной бумаги размером 7×9 см (тонкой) и мембраны из ПВДФ размером 5×8 см. Мембрану из ПВДФ перед использованием необходимо активировать этанолом в течение 2 минут;

6.2 Поместите зажим для переноса, две губки, фильтровальную бумагу и мембрану из активированного ПВДФ в контейнер с раствором для переноса;

6.3 Разложите папку переноса, красным слева и черным справа. Добавьте губку и по три кусочка фильтровальной бумаги с каждой стороны;

6.4 Осторожно снимите разделительный клей и поместите его на фильтровальную бумагу (клей нанесен на боковую часть черного зажима для переноса). Используйте жидкость для переноса, чтобы смыть пузырьки на клее. Медленно приклейте пленку ПВДФ на клей. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки. Затем по очереди наклейте трансферную пленку. Мембранная фильтровальная бумага, губка для переноса;

6.5 Условия переноса (мокрый перенос): постоянный ток, 300 мА в течение получаса.

7. Иммунный ответ

7.1 Поместите перенесенную мембрану в инкубационный бокс, содержащий TBST, быстро промойте ее, затем добавьте 5 мл 5% обезжиренного молока, поместите в шейкер для обесцвечивания и оставьте при комнатной температуре на 30 минут;

7.2. В соответствии с инструкциями к антителам разведите первичное антитело. После настройки вылейте блокирующий раствор в инкубационный бокс, добавьте подготовленное первичное антитело и инкубируйте при 4°C на шейкере в течение ночи (медленно встряхивайте шейкер);

7.3. Соберите первичное антитело, трижды быстро промойте мембрану TBST, затем добавьте TBST, поместите его на шейкер для обесцвечивания для быстрого элюирования, промывайте три раза по 5 минут каждый раз;

7.4. Разведите вторичное антитело TBST в соотношении 1:5000, затем добавьте его в инкубационный бокс, поместите на шейкер, медленно встряхните и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут;

7.5 Быстро промыть мембрану трижды TBST, затем добавить TBST, поместить на шейкер для обесцвечивания для быстрого элюирования, промыть три раза по 5 минут каждый раз.

8. Хемилюминесценция
Смешайте растворы ECL A и B в соотношении 1:1 и отставьте в сторону. Выньте элюированную мембрану из ПВДФ и поместите ее на впитывающую бумагу. Слегка впитайте жидкость на мембране и поместите мембрану в смешанный ECL. В люминесцентной жидкости дайте жидкости полностью погрузить мембрану. После реакции в течение 1 минуты выньте мембрану и поместите ее на лоток для хемилюминесцентных приборов. Запуск хемилюминесценции по заданной программе. После завершения экспонирования сохраните исходное изображение в формате TIFF.

9. Результаты и анализ Всемирного банка