Лизирующий буфер RIPA высокой эффективности для тканей и клеток

Введение в продукт

Лизисный буфер RIPA — это традиционный раствор для быстрого лизиса клеток и тканей. Он выпускается в различных формулах, которые в зависимости от интенсивности лизиса подразделяются на сильные, средние и слабые. Сильный лизирующий буфер RIPA подходит для лизирования тканей и клеток для получения образцов белков для традиционных методов, таких как электрофорез в ПААГ и вестерн-блот, где не требуется строгого сохранения активности белка. Основные компоненты этого продукта включают 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА-2Na, 1% Тритон X-100, 1% дезоксихолат натрия и 0,1% SDS. Он применим для образцов тканей и клеток животных и растений, а также может быть использован для образцов грибов и бактерий.

Спецификация продукта

В этом продукте используется вещество с восстанавливающими свойствами, сопоставимыми с дитиотреитолом (ДТТ) или β-меркаптоэтанолом (имеющим сильный запах), при этом оно не имеет запаха и демонстрирует улучшенную стабильность в водных растворах. Его эффективность не существенно отличается от эффективности традиционных буферов для электрофореза белков в SDS-ПААГ, что делает процедуры нанесения белков более безопасными и полезными для здоровья.

Хранилище

Транспортируется с пакетами со льдом (влажный лед); хранится при температуре -20°С, годен в течение 12 месяцев.

Операция Шаг

Ингибиторы протеазы готовятся отдельно. Ингибиторы протеазы необходимо добавлять в лизирующий буфер RIPA (сильный) непосредственно перед использованием. Для предотвращения деградации белка рекомендуется использовать G2006, G2007, G2008 или аналогичные продукты. В следующих процедурах «лизирующий буфер RIPA (сильный)» относится к буферу, уже содержащему ингибиторы протеазы.

Для образцов тканей:
1. Промойте кусочек ткани предварительно охлажденным PBS, чтобы удалить примеси крови, и измельчите его в гомогенизаторе на мелкие фрагменты.

2. Добавьте 10 объёмов (относительно массы ткани) лизирующего буфера RIPA (сильного) и гомогенизируйте при низких температурах (рекомендуется высокоскоростной гомогенизатор тканей YB-HL). Примечание: количество используемого лизирующего буфера RIPA (сильного) обычно составляет примерно 500 мкл на 50 мг ткани. Если в ткани низкое содержание белка, количество лизирующего буфера можно уменьшить для повышения его концентрации в неочищенном экстракте.

3. Перенесите гомогенат в центрифужную пробирку объёмом 1,5 мл и встряхните на вортексе. Инкубируйте на льду в течение 30 минут, периодически пипетируя каждые 10 минут для полного лизиса клеток ткани.

4. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 5 минут. Соберите супернатант, представляющий собой раствор общего белка.

Для образцов адгезивных клеток:

1. Промойте клетки PBS 2–3 раза, тщательно аспирируя остаточную жидкость после окончательной промывки.

2. Добавьте лизирующий буфер RIPA (Strong) в планшет или колбу для культивирования клеток в соотношении 250 мкл на лунку 6-луночного планшета. Аккуратно покачайте планшет или колбу, чтобы обеспечить полный контакт лизирующего буфера с клетками в течение 3–5 минут.

3. Соскребите клетки с помощью клеточного скребка и поместите их в центрифужную пробирку.

4. Лизируйте клетки на льду в течение 30 минут.

5. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 5 минут. Соберите супернатант, представляющий собой раствор общего белка.

Для образцов суспензионных клеток:

1. Соберите клетки центрифугированием.

2. Смешайте клеточный осадок с лизирующим буфером RIPA (сильным) в соотношении, соответствующем 250 мкл на лунку 6-луночного планшета, и встряхните.

3. Инкубируйте на льду в течение 30 минут, несколько раз пипетируя каждые 10 минут, чтобы обеспечить полный лизис клеток.

4. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 5 минут. Соберите супернатант, представляющий собой раствор общего белка.

Для бактериальных или грибковых образцов:

1. Возьмите 1 мл микробной суспензии, центрифугируйте для удаления надосадочной жидкости, промойте один раз PBS и тщательно удалите жидкость. Встряхните на вортексе для максимального рассеивания осадка.

2. Добавьте 100–200 мкл лизирующего буфера RIPA (сильного) и аккуратно встряхните, чтобы тщательно перемешать микробные клетки с лизирующим буфером.

3. Инкубируйте на льду в течение 10 минут, несколько раз пипетируя каждые 2 минуты, чтобы обеспечить полный лизис микроорганизмов.

4. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 5 минут. Соберите супернатант, представляющий собой раствор общего белка.

Уведомление

1. В процессе лизиса тканей или клеток лизат может стать вязким. Повторно пипетируйте смесь или встряхивайте её на вортексе до разжижения. Если лизат остаётся слишком вязким, добавьте необходимое количество лизирующего буфера.

2. Данный реагент не содержит ингибиторов протеаз. Ингибиторы протеаз необходимо готовить отдельно и добавлять непосредственно перед использованием. Мы рекомендуем использовать ингибиторы протеаз нашего производства.

3. Во время работы надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки.