Набор для очистки ДНК ПЦР-продукта с центрифужной колонкой

Введение в продукт

В присутствии высококонцентрированной хаотропной соли фрагменты ДНК избирательно связываются с кремнеземной мембраной в центрифужной колонке. В результате серии быстрых этапов промывки и центрифугирования примеси, такие как праймеры, нуклеотиды, белки и ферменты, удаляются с помощью промывочного буфера. Наконец, для элюирования очищенной ДНК с кремнеземной мембраны используется элюирующий буфер с низкой концентрацией соли и высоким pH.

I. Информация о продукте:

II.Условия хранения:

1.Этот набор можно хранить в течение 12 месяцев в сухих условиях при комнатной температуре (15–25 °C).

2. Все растворы должны быть прозрачными. Если из-за низкой температуры образуется осадок, растворы нельзя использовать непосредственно. Прогревание в водяной бане при температуре 37°C в течение нескольких минут восстановит прозрачность. Перед использованием дайте растворам остыть до комнатной температуры.

3.Хранение при низких температурах (4°C или –20°C) может привести к выпадению осадка и повлиять на эксплуатационные характеристики; поэтому транспортировку и хранение следует проводить при комнатной температуре (15°C–25°C).

4.Чтобы предотвратить испарение, окисление или изменение pH из-за длительного воздействия воздуха, плотно закрывайте все емкости с раствором крышками сразу после использования.

III. Материалы, которые должен подготовить пользователь:

Абсолютный этанол, настольная высокоскоростная центрифуга, водяная баня с постоянной температурой, пипетки, электрофоретическая камера, система визуализации гелей и т. д.; ДНК-маркер, краситель для загрузки образцов, агароза, электрофоретический буфер (1× TAE или 0,5× TBE), центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и т. д.

IV. Описание продукта:

В присутствии высококонцентрированной хаотропной соли фрагменты ДНК избирательно связываются с кремнеземной мембраной в центрифужной колонке. В результате серии быстрых этапов промывки и центрифугирования примеси, такие как праймеры, нуклеотиды, белки и ферменты, удаляются с помощью промывочного буфера. Наконец, для элюирования очищенной ДНК с кремнеземной мембраны используется элюирующий буфер с низкой концентрацией соли и высоким pH.

V. Характеристики продукта:

1.Все кремнеземные мембраны в центрифужных колонках изготовлены из высококачественного, специально разработанного адсорбционного материала, что обеспечивает минимальные различия в связывающей способности между колонками.

2.Высококачественный лизисный буфер не содержит йодида натрия или перхлората, обычно встречающихся в традиционных составах, что позволяет избежать ингибирования последующих ферментативных реакций, таких как расщепление, лигирование и клонирование после выделения.

3.Лизисный буфер окрашен феноловым красным, что придает ему желтый цвет, облегчающий визуальный мониторинг процесса лизиса и изменений pH, тем самым оптимизируя условия связывания и значительно повышая эффективность извлечения.

4.Усовершенствованная формула лизирующего буфера Buffer DD значительно повышает буферную емкость и стабильность, поддерживая pH в оптимальном диапазоне связывания даже при работе с образцами различных типов, сильно различающимися по своим свойствам.

5. Данная процедура быстрая и удобная, исключающая необходимость использования токсичных реагентов, таких как фенол и хлороформ, а также осаждения этанолом.

VI. Применение:

Данный продукт подходит для очистки и выделения продуктов ПЦР-реакции, ферментативно расщепленных фрагментов ДНК, продуктов мечения зондов, а также для концентрирования образцов ДНК и других применений.

VII. Меры предосторожности:

1.Данный продукт предназначен исключительно для исследовательских целей. Он не разрешен для применения в медицине, клинической диагностике, пищевой промышленности, косметике или смежных областях.

2. Все этапы центрифугирования следует проводить при комнатной температуре с использованием обычной настольной центрифуги, способной развивать скорость до 13 000 об/мин.

3.Буфер BB содержит раздражающие вещества. Во время работы следует носить латексные перчатки, чтобы избежать контакта с кожей, глазами или одеждой. В случае попадания на кожу или в глаза немедленно промыть большим количеством воды или физиологического раствора.

4.Типичный диапазон извлечения очищенных фрагментов ДНК составляет от 100 п.н. до 40 кб. Эффективность извлечения значительно снижается для фрагментов короче или длиннее этого диапазона.

5. Количество извлекаемой ДНК зависит от исходного количества ДНК, объема элюции и размера фрагментов ДНК. В обычных условиях для фрагментов ДНК размером от 1 до 15 мкг и от 100 пар оснований до 5 кб степень извлечения может достигать 95%.

6.Элюционный буфер EB не содержит хелатирующего агента ЭДТА и не повлияет на последующее ферментативное расщепление, лигирование или другие реакции. Для элюции также можно использовать воду, но убедитесь, что ее pH выше 7,5, так как чрезмерно низкий pH снизит эффективность элюции. ДНК, элюированную водой, следует хранить при –20°C. Для длительного хранения ДНК можно элюировать буфером TE (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0); однако ЭДТА может препятствовать последующему ферментативному расщеплению. При использовании рекомендуется соответствующее разведение.

7.Относительно использования буфера BL

1. Введение: при длительном хранении кремниевая мембрана в центрифужных колонках для связывания нуклеиновых кислот может реагировать с переносимыми по воздуху зарядами или пылью, что может снизить ее способность связывать нуклеиновые кислоты. Предварительная обработка колонки буфером BL значительно уменьшает количество гидрофобных групп на кремниевой мембране и повышает ее способность связывать нуклеиновые кислоты, тем самым улучшая выход или эффективность выделения ДНК. Кондиционирующий раствор представляет собой сильнощелочной раствор. В случае случайного попадания тщательно промойте большим количеством водопроводной воды. Всегда плотно закрывайте крышку бутылки после использования, чтобы избежать контакта с воздухом. Хранить при комнатной температуре. Во время хранения может образовываться осадок; если он присутствует, нагрейте при 37°C до полного растворения осадка перед использованием.
2. Процедура: Поместите новую центрифужную колонку с кремниевой мембраной в пробирку для сбора. Пипеткой внесите 100 мкл буфера BL в колонку. Центрифугируйте при 13 000 об/мин в течение 1 минуты. Слейте жидкость из пробирки для сбора и верните центрифужную колонку в ту же пробирку. Колонка готова к использованию. Перейдите к следующим шагам.

VIII. Процедура (Пожалуйста, ознакомьтесь с мерами предосторожности перед началом эксперимента):

Примечание: Перед первым использованием добавьте указанное количество безводного этанола в промывочный буфер WB и тщательно перемешайте. После добавления немедленно поставьте галочку в соответствующем поле, чтобы отметить, что этанол добавлен, во избежание повторного добавления.

1.Добавьте 500 мкл буфера для связывания BB к каждыми 100 мкл реакционной смеси после ПЦР-амплификации или после ферментативного расщепления и тщательно перемешайте. (Если начальный объем меньше 100 мкл, предварительно доведите его до 100 мкл с помощью дважды дистиллированной воды.)

Подготовка колонки с помощью буфера BL:

Предварительная обработка центрифужной колонки с кремниевой мембраной буфером BL является обязательным этапом. Подробный метод описан в предыдущем разделе «Использование раствора для подготовки колонки».

2.Перелейте раствор из предыдущего этапа в колонку Spin EC (помещенную в пробирку для сбора). Оставьте при комнатной температуре на 1 минуту, затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30–60 секунд. Удалите жидкость, прошедшую через колонку, из пробирки для сбора.

После смешивания с остаточным сильнощелочным раствором, оставшимся в пробирке, связывающий буфер может изменить цвет с желтого на оранжево-красный или даже фиолетовый. Это нормальное изменение цвета индикатора pH фенолового красного в щелочных условиях.

3. Добавьте 600 мкл промывочного буфера WB (пожалуйста, убедитесь, что безводный этанол был добавлен заранее!), затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30 секунд и удалите прошедший через фильтр раствор.

4.Добавьте 600 мкл промывочного буфера WB, затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30 секунд и удалите прошедший через фильтр раствор.

5.Поместите колонку Spin EC обратно в пустую пробирку для сбора и центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 2 минут, чтобы тщательно удалить остатки промывочного буфера, поскольку любой оставшийся этанол в промывочном буфере может ингибировать последующие реакции.

6.Перенесите колонку Spin EC в чистую центрифужную пробирку. Нанесите 50 мкл элюирующего буфера EB (предварительно нагретого в водяной бане при температуре 65–70°C для достижения лучших результатов) непосредственно на центр адсорбционной мембраны. Оставьте при комнатной температуре на 2 минуты, затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 1 минуты. Если требуется более высокий выход ДНК, элюат можно повторно загрузить на ту же колонку и центрифугировать еще одну минуту.

Увеличение объема элюции приводит к повышению эффективности элюции. Если требуется более высокая концентрация ДНК, объем элюции можно соответствующим образом уменьшить. Однако минимальный объем не должен быть меньше 25 мкл, поскольку чрезмерно малый объем снизит эффективность элюции ДНК и уменьшит общий выход продукта.