Набор для выделения общей РНК UltraPure методом центрифужной колонки для биологических исследований

Введение в продукт

Набор для быстрой экстракции общей РНК UltraPure предназначен для выделения общей РНК из широкого спектра тканей животных и растений, а также клеток. Лизисный буфер RL эффективно лизирует ткани и клетки, одновременно инактивируя РНКазы. В сочетании со специальными центрифужными колонками он позволяет получить высокочистую, высококачественную общую РНК, свободную от таких примесей, как белки, геномная ДНК и клеточные метаболиты.

Выделенная суммарная РНК обладает хорошей целостностью и не содержит примесей белков и ДНК. Она подходит для различных рутинных экспериментов в области молекулярной биологии, включая ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, Нозерн-блоттинг, дот-блоттинг, селекцию поли-А, трансляцию in vitro, создание библиотек кДНК и многое другое.

Технические характеристики изделия

1. Кремниевая мембрана во всех центрифужных колонках изготовлена ​​из высококачественного, специально разработанного материала, что обеспечивает минимальные различия в связывающей способности между колонками.

2. Сочетание стабильности и высокой чистоты одностадийных реагентов на основе тиоцианата гуанидиния/фенола с удобством использования центрифужных колонок. Исключает необходимость осаждения изопропанолом и промывки этанолом. РНК элюируется непосредственно из колонки, что позволяет избежать проблем с затрудненным ресуспендированием из-за пересыхания.

3. Уникальная формула лизирующего буфера RL эффективно устраняет загрязнение геномной ДНК.

4. Многократная промывка колонки удаляет загрязняющие белки и клеточные метаболиты, что позволяет получить РНК высокой чистоты.

5. Эффективно снижает содержание 5S РНК в общей РНК, повышая ее чистоту.

Этапы операции

Подготовка к эксперименту:

1.По возможности используйте стерильные микроцентрифужные пробирки, наконечники для пипеток и другие одноразовые пластиковые расходные материалы, не содержащие РНКазы. При использовании стеклянной посуды или многоразовых инструментов предварительно обработайте их ДЭПК или используйте средство для дезинфекции от РНКазы.

(1)Замочите инструменты/контейнеры в 0,1%-ном водном растворе диэтилпирокарбоната (DEPC) в защищенном от света месте на 12 часов.

(2) Автоклавирование при 121°C в течение 30 минут для удаления остатков DEPC.

2. Во время подготовки реагентов и проведения экспериментальных процедур необходимо надевать лабораторный халат, одноразовые латексные перчатки и одноразовую маску, чтобы избежать загрязнения РНКазой.

Предварительная обработка образца:

1.Гомогенизация тканей:

А.Ткань растения: Тщательно измельчите свежую ткань растения в жидком азоте или мелко нарежьте ткань и измельчите ее непосредственно в лизирующем буфере RL. Добавьте 1 мл буфера RL на 50-100 мг ткани и перемешайте. Примечание: Объем образца, как правило, не должен превышать 10% от объема буфера RL.

Б.Ткань животного: Измельчите свежую или замороженную при -70°C ткань животного как можно мельче. Добавьте 1 мл лизирующего буфера RL на каждые 30-100 мг ткани и гомогенизируйте с помощью гомогенизатора. В качестве альтернативы, измельчите в жидком азоте, затем добавьте 1 мл буфера RL и перемешайте. Примечание: Объем образца, как правило, не должен превышать 10% от объема буфера RL.

С.Клетки, культивируемые в монослое (адгезивные клетки): После максимально полного удаления культуральной среды, добавьте 1 мл лизирующего буфера RL, чтобы покрыть клетки в чашке Петри диаметром 3,5 см, и проведите лизис путем многократного пипетирования. Необходимое количество буфера RL определяется площадью культивируемой поверхности, а не количеством клеток (добавьте 1 мл на 10 см²). Недостаточное количество буфера RL может привести к загрязнению ДНК в выделенной РНК.

Примечание: Прикрепившиеся клетки могут не полностью отделиться от колбы/чашки Петри. Это не означает неполного лизиса, поскольку клеточные мембраны, скорее всего, полностью разорваны, и РНК высвобождается. Продолжайте выполнение протокола.

Д.Суспендированные клетки: Осадите клетки центрифугированием. Лизируйте осадок в лизирующем буфере RL, многократно пипетируя. Добавьте 1 мл лизирующего буфера RL на 5–10 × 10⁶ клеток животных, растений или дрожжей, или на 1 × 10⁷ бактериальных клеток. Избегайте промывания клеток перед добавлением буфера RL, так как это может усилить деградацию мРНК. Для разрушения некоторых дрожжевых и бактериальных клеток может потребоваться гомогенизатор.

Е.Для выделения бактериальной РНК рекомендуется использовать набор для выделения бактериальной РНК (с центрифужной колонкой) (кат. № YBR3220). Для выделения РНК из крови рекомендуется использовать набор для выделения общей РНК из цельной крови (жидкий образец) TRI (кат. № YBR3208).

Этапы экстракции:

1.Тщательно перемешайте гомогенат на вортексе и выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут для полного распада нуклеопротеиновых комплексов.

2.Дополнительный шаг: центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 10 минут при 4°C и перенесите надосадочную жидкость. Этот шаг позволяет удалить осадок, если образец содержит большое количество белка, жира, полисахаридов или таких материалов, как мышечная ткань или клубни растений. Осадок содержит клеточные стенки, полисахариды и высокомолекулярную ДНК, а надосадочная жидкость — РНК. Для образцов жировой ткани удалите верхний липидный слой и используйте прозрачный гомогенат для следующего шага.

3.Добавьте 0,2 мл хлороформа на 1 мл используемого лизирующего буфера RL. Плотно закройте пробирку крышкой, энергично встряхивайте на вортексе в течение 15 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 минут.

4.Центрифугирование проводили при 12 000 об/мин в течение 10-15 минут при 4°C в высокоскоростной охлаждаемой центрифуге. После центрифугирования смесь разделялась на три фазы: нижнюю красную органическую фазу, межфазную область и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК содержалась в верхней водной фазе, объем которой составлял приблизительно 50-60% от исходного объема буфера RL.

5.Осторожно перенесите водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку, свободную от РНКазы (избегайте контакта с межфазной границей). Запишите объем водной фазы. Добавьте 0,5 объема безводного этанола (относительно объема водной фазы) и немедленно перемешайте пипеткой.

6.Перенесите смесь (при необходимости порциями по ≤700 мкл) на колонку SpinRA. Центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 45 секунд. Удалите прошедший через колонку раствор и поместите колонку обратно в пробирку для сбора.

7.Добавьте 500 мкл буфера для депротеинизации RE. Центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 45 секунд при комнатной температуре. Удалите прошедший через центрифугирование раствор.

8.Добавьте 500 мкл промывочного буфера RW (убедитесь, что этанол был добавлен предварительно). Центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 45 секунд. Удалите прошедший через центрифугирование раствор.

9.Повторите шаг 9 еще раз.4

10.Поместите колонку SpinRA обратно в пустую пробирку для сбора. Центрифугируйте при 13 000 об/мин в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы полностью высушить мембрану. Удаление остаточного этанола имеет решающее значение, поскольку он может ингибировать последующие реакции.

11.Перенесите колонку SpinRA в новую микроцентрифужную пробирку, не содержащую РНКазы (избегайте контакта дна колонки с проходящим через нее раствором). Нанесите 50-80 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно в центр мембраны. Оставьте при комнатной температуре на 2 минуты. Центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 1 минуты для элюирования РНК. Храните элюированную РНК при -80°C для предотвращения деградации.

Увеличение объема элюции приводит к повышению эффективности элюции. При более высокой концентрации РНК объем элюции можно уменьшить, но рекомендуется использовать не менее 30 мкл, поскольку очень малые объемы снижают эффективность и выход продукта.