Набор для очистки фрагментов ДНК методом центрифугирования в биологических исследованиях

Введение в продукт

В присутствии высококонцентрированной хаотропной соли фрагменты ДНК избирательно связываются с кремнеземной мембраной в центрифужной колонке. В результате серии быстрых этапов промывки и центрифугирования примеси, такие как праймеры, нуклеотиды, белки и ферменты, удаляются с помощью промывочного буфера. Наконец, для элюирования очищенной ДНК с кремнеземной мембраны используется элюирующий буфер с низкой концентрацией соли и высоким pH.

I. Информация о продукте:

II. Условия хранения:

1.Этот набор можно хранить в течение 12 месяцев в сухих условиях при комнатной температуре (15–25 °C).

2. Все растворы должны быть прозрачными. Если из-за низкой температуры образуется осадок, растворы нельзя использовать непосредственно. Прогревание в водяной бане при температуре 37°C в течение нескольких минут восстановит прозрачность. Перед использованием дайте растворам остыть до комнатной температуры.

3.Хранение при низких температурах (4°C или –20°C) может привести к выпадению осадка и повлиять на эксплуатационные характеристики; поэтому транспортировку и хранение следует проводить при комнатной температуре (15°C–25°C).

4.Чтобы предотвратить испарение, окисление или изменение pH из-за длительного воздействия воздуха, плотно закрывайте все емкости с раствором крышками сразу после использования.

III. Материалы, которые должен подготовить пользователь:

Абсолютный этанол, настольная высокоскоростная центрифуга, водяная баня с постоянной температурой, пипетки, электрофоретическая камера, система визуализации гелей и т. д.; ДНК-маркер, краситель для загрузки образцов, агароза, электрофоретический буфер (1× TAE или 0,5× TBE), центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и т. д.

IV. Описание продукта:

В присутствии высококонцентрированной хаотропной соли фрагменты ДНК избирательно связываются с кремнеземной мембраной в центрифужной колонке. В результате серии быстрых этапов промывки и центрифугирования примеси, такие как праймеры, нуклеотиды, белки и ферменты, удаляются с помощью промывочного буфера. Наконец, для элюирования очищенной ДНК с кремнеземной мембраны используется элюирующий буфер с низкой концентрацией соли и высоким pH.

V. Характеристики продукта:

1.Все кремнеземные мембраны в центрифужных колонках изготовлены из высококачественного, специально разработанного адсорбционного материала, что обеспечивает минимальные различия в связывающей способности между колонками.

2. В нем используется высококачественный лизисный буфер, не содержащий йодида натрия или перхлората, обычно встречающихся в традиционных составах, что позволяет избежать ингибирования последующих ферментативных реакций, таких как расщепление, лигирование и клонирование после выделения.

3. Уникальная формула буфера DB объединяет функции лизиса и связывания, что позволяет использовать один набор для различных задач, таких как выделение ДНК из агарозных гелей, очистка и выделение продуктов ПЦР, а также очистка и выделение продуктов ферментативного расщепления. Это устраняет необходимость приобретения нескольких специализированных наборов, что приводит к экономии средств.

4.Буферный раствор DB окрашен в желтый цвет для облегчения визуального контроля процесса лизиса и изменений pH, что позволяет достичь оптимальных условий связывания и значительно повысить эффективность извлечения.

5.Усовершенствованная формула лизирующего буфера значительно повышает буферную емкость и стабильность, поддерживая pH в оптимальном диапазоне связывания даже при работе с образцами различных типов, сильно различающимися по своим свойствам.

6. Данная процедура быстрая и удобная, исключающая необходимость использования токсичных реагентов, таких как фенол и хлороформ, а также осаждения этанолом.

VI. Применение:

Данный продукт подходит для выделения ДНК из агарозных гелей, очистки и выделения продуктов ПЦР-реакции, очистки и выделения фрагментов ДНК, подвергнутых ферментативному расщеплению, очистки после мечения зондами, концентрирования образцов ДНК и других смежных применений.

VII. Меры предосторожности:

1. Данный продукт предназначен исключительно для исследовательских целей. Он не разрешен для применения в медицине, клинической диагностике, пищевой промышленности, косметике или смежных областях.

2. Все этапы центрифугирования следует проводить при комнатной температуре с использованием обычной настольной центрифуги, способной развивать скорость до 13 000 об/мин.

3.Связывающий буфер содержит раздражающие вещества. Во время работы следует носить латексные перчатки, чтобы избежать контакта с кожей, глазами или одеждой. В случае попадания на кожу или в глаза немедленно промыть большим количеством воды или физиологического раствора.

4. Типичный диапазон извлечения очищенных фрагментов ДНК составляет от 100 п.н. до 40 кб. Эффективность извлечения значительно снижается для фрагментов короче или длиннее этого диапазона.

5. Количество извлекаемой ДНК зависит от исходного количества ДНК, объема элюции и размера фрагментов ДНК. В обычных условиях для фрагментов ДНК размером от 1 до 15 мкг и от 100 пар оснований до 5 кб степень извлечения может достигать 95%.

6.Элюционный буфер EB не содержит хелатирующего агента ЭДТА и не повлияет на последующее ферментативное расщепление, лигирование или другие реакции. Для элюции также можно использовать воду, но убедитесь, что ее pH > 7,5, так как чрезмерно низкий pH снизит эффективность элюции. ДНК, элюированную водой, следует хранить при –20°C. Для длительного хранения ДНК можно элюировать буфером TE (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0); однако ЭДТА может препятствовать последующему ферментативному расщеплению. При использовании рекомендуется соответствующее разведение.

7. Относительно использования буфера BL

1. Введение: при длительном хранении кремнеземная мембрана в спин-колонках для связывания нуклеиновых кислот может реагировать с переносимыми по воздуху зарядами или пылью, что может снизить ее способность связывать нуклеиновые кислоты. Предварительная обработка колонки буфером BL значительно уменьшает количество гидрофобных групп на кремнеземной мембране и повышает ее способность связывать нуклеиновые кислоты, тем самым улучшая выход или эффективность выделения ДНК. Кондиционирующий раствор представляет собой сильнощелочной раствор. В случае случайного попадания тщательно промойте большим количеством водопроводной воды. Всегда плотно закрывайте крышку бутылки после использования, чтобы избежать контакта с воздухом. Хранить при комнатной температуре. Во время хранения может образовываться осадок; если он присутствует, нагрейте при 37°C до полного растворения осадка перед использованием.

2. Процедура: Поместите новую центрифужную колонку с кремниевой мембраной в пробирку для сбора. Пипеткой внесите 100 мкл буфера BL в колонку. Центрифугируйте при 13 000 об/мин в течение 1 минуты. Слейте жидкость из пробирки для сбора и верните центрифужную колонку в ту же пробирку. Колонка готова к использованию. Перейдите к следующим шагам.

VIII. Процедура (Пожалуйста, ознакомьтесь с мерами предосторожности перед началом эксперимента):

Примечание: Перед первым использованием добавьте указанное количество безводного этанола в промывочный буфер WB и тщательно перемешайте. После добавления немедленно поставьте галочку в поле, подтверждающее добавление этанола, чтобы избежать повторного добавления.

(1)Извлечение ДНК из агарозных гелей

1.Под воздействием длинноволнового ультрафиолетового излучения чистым лезвием вырежьте целевую полосу ДНК. Удалите как можно больше геля без ДНК, чтобы минимизировать конечный объем геля.

2.Перенесите вырезанный фрагмент геля, содержащий полосу ДНК, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и взвесьте его.

Сначала взвесьте пустую пробирку объемом 1,5 мл, затем взвесьте ее еще раз после добавления кусочка геля. Вычтите полученные значения, чтобы получить вес геля.

3.Добавьте 3 тома базы данных Buffer DB.

Если масса геля составляет 100 мг, его объем можно считать приблизительно равным 100 мкл; соответственно, следует добавить 300 мкл лизирующего буфера.

Если концентрация геля превышает 2%, добавьте 6 объемов лизирующего буфера.

4. Выдерживать при температуре 56°C в течение 10 минут (или до полного растворения геля). Для облегчения и ускорения растворения перемешивать на вортексе каждые 2–3 минуты.

5. Необязательно (обычно не требуется): добавьте 150 мкл изопропанола на каждые 100 мг исходной массы геля и тщательно перемешайте с помощью вихревого перемешивателя.

В некоторых случаях добавление изопропанола может повысить эффективность извлечения. Не следует центрифугировать после добавления изопропанола.

При выделении фрагментов размером более 4 кб изопропанол добавлять не следует, так как это может снизить эффективность выделения.

Подготовка колонки с помощью буфера BL:

Предварительная обработка центрифужной колонки с кремниевой мембраной буфером BL является обязательным этапом. Подробный метод описан в предыдущем разделе «Использование раствора для подготовки колонки».

6. Перелейте полученный на предыдущем этапе раствор в колонку Spin EC (помещенную в пробирку для сбора). Оставьте при комнатной температуре на 1 минуту, затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30–60 секунд. Удалите жидкость, прошедшую через колонку, из пробирки для сбора.

Если общий объем превышает 750 мкл, раствор можно загрузить на одну и ту же колонку Spin EC двумя отдельными партиями.

После смешивания с остаточным сильнощелочным раствором, оставшимся в пробирке для сбора, отфильтрованный лизисный/связывающий буфер может изменить цвет с желтого на оранжево-красный или даже фиолетовый. Это нормальное изменение цвета индикатора pH фенолового красного в щелочных условиях.

7.Добавьте 600 мкл промывочного буфера WB (пожалуйста, убедитесь, что предварительно не добавлен безводный этанол!), центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30 секунд и удалите прошедший через фильтр раствор.

8. Добавьте 600 мкл промывочного буфера WB, центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30 секунд и удалите прошедший через центр раствор.

9. Поместите колонку Spin EC обратно в пустую пробирку для сбора и центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 2 минут, чтобы тщательно удалить остатки промывочного буфера, поскольку любой оставшийся этанол в промывочном буфере может ингибировать последующие реакции.

10. Перенесите колонку Spin EC в чистую центрифужную пробирку. Нанесите 50 мкл элюирующего буфера EB (предварительно нагретого в водяной бане при температуре 65–70 °C для достижения лучших результатов) непосредственно на центр адсорбционной мембраны. Оставьте при комнатной температуре на 2 минуты, затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 1 минуты. Если требуется более высокий выход ДНК, элюат можно повторно загрузить на ту же колонку и центрифугировать еще одну минуту.

Увеличение объема элюции обычно приводит к повышению эффективности элюции. Если требуется более высокая концентрация ДНК, объем элюции может быть соответствующим образом уменьшен; однако минимальный объем не должен быть меньше 25 мкл, поскольку чрезмерно малый объем снизит эффективность элюции ДНК и уменьшит общий выход продукта.

(2) Очистка ДНК от продуктов ПЦР или фрагментов после расщепления:

1. На каждые 100 мкл смеси после ПЦР-амплификации или после ферментативного расщепления добавьте 500 мкл лизирующего/связывающего буфера DB и тщательно перемешайте. (Если начальный объем меньше 100 мкл, предварительно доведите его до 100 мкл с помощью дважды дистиллированной воды.)

2.Перелейте раствор, полученный на предыдущем этапе, в колонку Spin EC (помещенную в пробирку для сбора). Оставьте при комнатной температуре на 1 минуту, затем центрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 30–60 секунд и удалите жидкость, прошедшую через колонку, из пробирки для сбора.

3. Начиная с этого этапа, процедура выполняется точно так же, как и на этапах 7–10 по выделению ДНК из агарозных гелей. Пожалуйста, обратитесь к этапам 7–10 протокола «Выделение ДНК из агарозных гелей».