Набор для ИФА Rat ESM1 (Endothelial Cell Specific Molecule 1)

I. Информация о продукте:

Данный набор для ИФА использует сэндвич-иммуноанализа для обнаружения крысиного ESM1. Микропланшет предварительно покрыт захватывающим антителом, специфичным к целевому аналиту. После добавления стандартов или образцов крысиный ESM1 связывается с иммобилизованным антителом. Последующие этапы включают последовательное добавление конъюгированного с биотином детектирующего антитела и конъюгата авидин-пероксидаза хрена (HRP). После инкубации и промывки для удаления несвязанных реагентов добавляется раствор субстрата. Лунки, содержащие полный комплекс — крысиный ESM1, биотинилированное антитело и авидин-HRP — приобретают синий цвет. Реакция останавливается добавлением кислого раствора, в результате чего получается желтая конечная точка. Абсорбция измеряется при 450 нм ± 2 нм, при этом оптическая плотность (OD) напрямую коррелирует с концентрацией крысиного ESM1. Концентрации образцов количественно определяются путем интерполяции их значений OD по стандартной кривой.

II. Пример протокола тестирования:

1. Для проведения анализа рекомендуется использовать свежие образцы, не подвергавшиеся длительному хранению. В противном случае в таких образцах может произойти деградация и денатурация белка, что в конечном итоге приведет к неверным результатам.

2. Мы несем ответственность только за сам набор, но не за образцы, использованные во время анализа. Пользователи должны рассчитать возможное количество образцов, необходимых для всего анализа. Пожалуйста, зарезервируйте достаточное количество образцов заранее.

3. Диапазон обнаружения набора не соответствует диапазону концентрации аналита в образце. Рекомендуется обратиться к справочным материалам, провести предварительные эксперименты или обратиться за технической поддержкой для оценки концентрации аналита в вашем образце. Если концентрация аналита в образце слишком высока или слишком низка, следует провести соответствующее разбавление или концентрирование образца.

4. Если тип образца не указан в руководстве, рекомендуется провести предварительный эксперимент для проверки его достоверности.

III. Подготовка реагентов:

1. Перед использованием доведите все реагенты до комнатной температуры (18-25℃). Если набор не будет использован в одном анализе, извлеките только необходимые для данного эксперимента полоски и реагенты, а оставшиеся полоски и реагенты храните в требуемых условиях.

2. Буфер для промывки: разведите 30 мл концентрированного буфера для промывки 720 мл деионизированной или дистиллированной воды, чтобы получить 750 мл буфера для промывки. Примечание: если в концентрате образовались кристаллы, нагрейте его на водяной бане при температуре 40℃ и осторожно перемешивайте до полного растворения кристаллов.

3. Стандартное рабочее решение:

① Центрифугирование: центрифугируйте стандартный раствор при 10 000×g в течение 1 мин.

② Добавьте 1 мл стандартного образца и разбавителя, дайте постоять 10 минут, осторожно переворачивая стакан несколько раз. После полного растворения тщательно перемешайте пипеткой. В результате получается рабочий раствор с концентрацией 2000 пг/мл.
③ Последовательное разведение: Возьмите 7 пробирок EP, добавьте в каждую по 250 мкл стандартного раствора и буфера для разведения образца (объем можно регулировать в зависимости от фактического использования, например, 500 мкл/пробирка). Перелейте 250 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 2000 пг/мл в первую пробирку и тщательно перемешайте, чтобы получить рабочий раствор стандарта с концентрацией 1000 пг/мл. Продолжайте разведение шаг за шагом до предпоследней пробирки. Последняя пробирка будет служить контрольной, и переливать раствор из предпоследней пробирки не следует. Рабочий раствор стандарта следует готовить непосредственно перед использованием.

4. Рабочий раствор биотинилированного детектирующего антитела: Рассчитайте необходимое количество перед экспериментом (100 мкл/лунка). При приготовлении следует подготовить немного больше, чем рассчитано. Центрифугируйте концентрированное биотинилированное детектирующее антитело при 800×g в течение 1 мин, затем разведите 100× концентрированное биотинилированное детектирующее антитело до 1× рабочего раствора с помощью разбавителя для биотинилированного детектирующего антитела (соотношение концентрированного биотинилированного детектирующего антитела к разбавителю для биотинилированного детектирующего антитела = 1:99).

5. Рабочий раствор конъюгата HRP: Рассчитайте необходимое количество перед экспериментом (100 мкл/лунка). При приготовлении следует подготовить немного большее количество, чем рассчитано. Центрифугируйте концентрированный конъюгат HRP при 800×g в течение 1 мин, затем разбавьте 100×концентрированный конъюгат HRP до 1×рабочего раствора с помощью разбавителя конъюгата HRP (концентрированный конъюгат HRP:разбавитель конъюгата HRP = 1:99).

6. Советы по экспериментальной работе

① Растворы следует добавлять на дно лунки микропланшета для ИФА, избегая соприкосновения с внутренней стенкой и образования пены.

② Используйте тестируемые полоски сразу после промывки. Не допускайте высыхания полосок.

③ После добавления субстратного реагента время реакции можно сократить или увеличить в зависимости от фактического изменения цвета, но не более чем на 30 минут.

④ Добавление стоп-раствора следует производить в том же порядке, что и добавление субстратного раствора.

IV. Процедура анализа:

V. Примечание:
Только для исследований в области биологических наук.